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臨床微生物檢驗 - 基礎(chǔ)知識-常用的微生物培養(yǎng)基


發(fā)布時間:

2023-07-02

雖然自動化儀器已經(jīng)開始占領(lǐng)了微生物檢驗的市場,但是其成本是十分的高,特別是基層醫(yī)院很難用的起,所以我們不要忘了基礎(chǔ)的東西,從基礎(chǔ)一步一步去掌握我們的任何一個實驗室項目。不要因為有儀器直接給出相對正確的結(jié)果而忽略了您應(yīng)該知道的基礎(chǔ)知識。

文字是枯燥的,微生物也是枯燥的,忍受文字上帶來的不悅,耐心的和我一起學(xué)習(xí)去,也許就會帶來精神上的升華和臨床技術(shù)水平的提高。


第三節(jié):常用的微生物培養(yǎng)基

3.1培養(yǎng)基的組成成分

3.1.1營養(yǎng)物質(zhì)

細(xì)菌需要的基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)應(yīng)含有氮源、碳源、無機(jī)鹽類和生長因子等,常用的營養(yǎng)物質(zhì)如下:

蛋白胨提供氮源。是動物或植物蛋白質(zhì)經(jīng)酶或酸堿分解而成。含胨、多肽和多種氨基酸,為大多數(shù)細(xì)菌生長所利用,尤其是含大量色氨酸的胰蛋白胨,更適于測靛基質(zhì)用的蛋白胨。蛋白胨易溶于水,遇酸不沉淀,不因受高溫而凝固,并對兩性電解質(zhì)有緩沖作用。但吸水性強(qiáng),應(yīng)注意干燥密封保存。

肉浸液是用新鮮牛肉浸泡、煮沸而制成的肉汁。其中含有可溶性含氮浸出物(肌酸、黃嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤核苷酸、谷氨酸、甘氨酸等)和非含氮浸出物(肝糖、乳酸、琥珀酸、磷酸己糖、脂肪、無機(jī)鹽類等)。還有一些生長因子。肉浸液提供氮源和碳源,但肉浸液中所含氮物質(zhì)過少而不能滿足細(xì)菌的需要,因此在制備培養(yǎng)基時應(yīng)再加入1%~2%的蛋白胨和0.5%氯化鈉。

牛肉膏由肉浸液經(jīng)長時間加熱濃縮而制成。糖類在加熱過程中被破壞,所以其營養(yǎng)價值低于肉浸液,但因無糖可用作腸道桿菌鑒別培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。由于使用方便,常用于制備培養(yǎng)基。

糖類、醇類提供碳源和能源。制備培養(yǎng)基所用的糖類、醇類有多種,常用的糖類有單糖(葡萄糖、阿拉伯糖等)、雙糖(乳糖、蔗糖等)和多糖(淀粉、菊糖等);常用的醇類有甘露醇、衛(wèi)茅醇等。除葡萄糖、蔗糖主要作為碳源和能源的基本成分外,其他糖類和醇類主要用于鑒定細(xì)菌所做的發(fā)酵反應(yīng)。

無機(jī)鹽類提供細(xì)菌生長的各種元素,如:鉀、鈉、鐵、鎂、鈣、磷、硫等。用于制備培養(yǎng)基的無機(jī)鹽類有多種,其中最常用的有氯化鈉和磷酸鹽,前者對維持酶的活性、調(diào)節(jié)菌體內(nèi)外的滲透壓非常重要,后者是細(xì)菌良好的磷源,并在培養(yǎng)基中具有緩沖作用。

雞蛋和動物血清雖然不是構(gòu)成培養(yǎng)基的基本成分,但卻是某些細(xì)菌生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì),所以僅用于制備一些特殊的培養(yǎng)基,這些細(xì)菌直接從雞蛋和動物血清中獲取營養(yǎng)。如培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌的雞蛋培養(yǎng)基和培養(yǎng)白喉桿菌的呂氏血清培養(yǎng)基等。

生長因子是細(xì)菌生長所必需的,但需要量很小。在制備培養(yǎng)基時,常在肝浸液、肉浸液、酵母浸液和含血液培養(yǎng)基中加入維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等生長因子。

3.1.2凝固物質(zhì):制備固體培養(yǎng)基時,需要在液體中加入凝固物質(zhì)。最常用的凝固物質(zhì)為瓊脂,特殊情況下也可用明膠、卵白蛋白、血清等。無營養(yǎng)作用。

3.1.3抑制劑和指示劑:用于選擇、鑒定及判斷結(jié)果。

抑制劑有選擇抑制作用,抑制非檢出菌(非病原菌)的生長,以利于檢出菌(病原菌)的生長。常用的有膽鹽、煌綠、亞硫酸鈉、亞硒酸鈉及一些染料和某些抗生素等。

指示劑:觀察細(xì)菌是否利用和分解培養(yǎng)基中的糖、醇類。常用的有酚紅、中性紅、甲基紅、溴甲酚紫、溴麝香草酚藍(lán)、中國藍(lán)等酸堿指示劑。亞甲藍(lán)常用作氧化還原指示劑。

3.2培養(yǎng)基種類

3.2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基:含有基礎(chǔ)生長所需的基本營養(yǎng)成分,最常用的是肉浸液,俗稱肉湯,主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。基礎(chǔ)培養(yǎng)基廣泛用于細(xì)菌的增菌、檢驗,也是制備其他培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。

3.2.2營養(yǎng)培養(yǎng)基:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中可加入葡萄糖、血液、生長因子等特殊成分,供營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌和需要特殊生長因子的細(xì)菌生長。最常用的是血瓊脂平板、巧克力血平板(如下)等。

3.2.3鑒別培養(yǎng)基:利用細(xì)菌分解糖類和蛋白質(zhì)的能力及其代謝產(chǎn)物的不同,在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物和指示劑,觀察細(xì)菌生長過程中分解底物所釋放的不同產(chǎn)物,通過指示劑的反應(yīng)不同來鑒別細(xì)菌。如糖發(fā)酵管、克氏雙糖鐵瓊脂(KIA)、伊紅-亞甲藍(lán)瓊脂和動力-吲哚-尿素(MIU)培養(yǎng)基等。

3.2.4選擇培養(yǎng)基;在培養(yǎng)基中加入抑制劑,去抑制標(biāo)本中的雜菌生長,有助于所選擇的細(xì)菌種類的生長。例如培養(yǎng)腸道致病菌的SS瓊脂,其中的膽鹽能抑制革蘭陽性菌,枸櫞酸鈉和煌綠能抑制大腸埃希菌,因而使致病的沙門菌、志賀菌容易分離到。

3.2.5特殊培養(yǎng)基:包括厭氧培養(yǎng)基和細(xì)菌L型培養(yǎng)基等。前者是培養(yǎng)專性厭氧菌的培養(yǎng)基,除含營養(yǎng)成分外,還加入還原劑以降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢,如皰肉培養(yǎng)基、巰基乙醇酸鈉培養(yǎng)基等。后者是針對細(xì)胞壁缺損的細(xì)菌L型,由于胞內(nèi)滲透壓較高,故培養(yǎng)該菌時必須采用高滲(3%~5%NaCl、10%~20%蔗糖或7%聚乙烯吡咯烷酮等)低瓊脂培養(yǎng)基。

3.3分離培養(yǎng)基的選擇:臨床標(biāo)本送往細(xì)菌實驗室后,應(yīng)立即接種到適當(dāng)?shù)姆蛛x培養(yǎng)基上。依據(jù)衛(wèi)生部臨床檢驗中心推薦,細(xì)菌實驗室應(yīng)備有如下分離培養(yǎng)基:

3.3.1血平板適于各類細(xì)菌的生長,一般細(xì)菌檢驗標(biāo)本的分離,都應(yīng)接種此平板。

3.3.2巧克力血平板其中含有V和X因子,適于接種疑有嗜血桿菌、奈瑟菌等的標(biāo)本。

3.3.3中國藍(lán)平板或伊紅亞甲藍(lán)平板可抑制革蘭陽性細(xì)菌,有選擇地促進(jìn)革蘭陰性細(xì)菌生長,是較好的弱選擇性培養(yǎng)基。發(fā)酵型革蘭陰性桿菌因分解乳糖能力不同,在此平板上菌落顏色不同,便于鑒別菌種。

3.3.4麥康凱平板具中等強(qiáng)度選擇性,抑菌力略強(qiáng),有少數(shù)革蘭陰性菌不生長。在麥康凱平板上能否生長,是不發(fā)酵菌鑒定的一個依據(jù)。

3.3.5.SS瓊脂有較強(qiáng)的抑菌力,用于志賀菌和沙門菌的分離。因選擇性過強(qiáng),可影響檢出率,所以,使用時最好加一種弱選擇平板以配對互補(bǔ)。

3.3.6.堿性瓊脂或TCBS瓊脂用于從糞便中分離霍亂弧菌及其他弧菌。

3.3.7血液增菌培養(yǎng)基用于從血液、骨髓中分離常見病原菌。

3.3.8營養(yǎng)肉湯用于標(biāo)本及各類細(xì)菌的增菌培養(yǎng)。

3.3.9 MH瓊脂平板用于細(xì)菌的抗生素敏感試驗。MH瓊脂平板是WHO推薦的適用于K-B法測定細(xì)菌對抗菌藥物敏感性的培養(yǎng)基對于同種細(xì)菌不同藥敏紙片,抑菌環(huán)越大,表示抗生素對此細(xì)菌抑制能力越強(qiáng)。反之越弱。

3.3.10沙保弱培養(yǎng)基:白色念珠菌的鑒定和培養(yǎng)將檢材接種于沙保弱瓊脂培養(yǎng)基,攝氏25度孵育3-4天后,即可在培養(yǎng)基表面形成乳白色(偶見淡黃色)類酵母菌落。

3.3.11念珠菌顯色培養(yǎng)基用于白色念珠菌分離和鑒定通過顯色來區(qū)別不同念珠菌,白色念球菌顯藍(lán)綠色,熱帶念珠菌顯藍(lán)灰色或鐵藍(lán)色,光滑念珠菌顯紫色,克柔假絲酵母顯粉色,其它顯白3.3.12B群鏈球菌顯色平板添加了特異性的酶底物,經(jīng)B群鏈球菌的酶解作用釋放出顯色原從而使細(xì)菌呈現(xiàn)出不同的顏色淡紅色到深紅色是B群鏈球菌。藍(lán)色,綠色,無色或被抑制是其他細(xì)菌。

 

3.4根據(jù)標(biāo)本來源和可能存在的病原菌,確定選用各種分離培養(yǎng)基

大部分細(xì)菌培養(yǎng)的標(biāo)本血平板、巧克力平板

糞便標(biāo)本---EMB、SS、MAC、TCBS

酵母樣真菌培養(yǎng)---念珠菌顯色平板、沙保弱平板

淋病培養(yǎng)標(biāo)本淋球菌平板

中段尿---血平板,若做菌落計數(shù)時,可聯(lián)合血平板、普通營養(yǎng)瓊脂,及或麥康凱(或中國藍(lán))

腦脊液標(biāo)本---血瓊脂、巧克力瓊脂、麥康凱或中國藍(lán)平板、CHROMagar或者沙保羅瓊脂。若懷疑有專性厭氧菌感染時,可增加厭氧培養(yǎng)基。

痰標(biāo)本--血平板、加萬古霉素的巧克力平板、CHROMagar或含氯霉素的SDA等。

疑白喉--亞碲酸鉀血瓊脂、呂氏血清斜面或雞蛋斜面。

疑為百日咳桿菌--鮑-金(Bordet-Gengou)平板。

疑金葡感染致偽膜性腸炎的糞便標(biāo)本---疊氮鈉血瓊脂,亦可用選擇性培養(yǎng)基

疑似霍亂弧菌感染的糞便標(biāo)本----堿性蛋白胨水

懷疑有苛養(yǎng)菌(淋球菌、杜克雷嗜血桿菌等)感染者的尿細(xì)菌培養(yǎng)--加種巧克力培養(yǎng)基和TM培養(yǎng)基。

 

信息來源:司南說檢驗微信公眾號

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